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细胞计数和存活率的测定

2019-06-29 16:04:57 养殖种植技术书籍

细胞计数和存活率的测定

目的 学会细胞计数和鉴别细胞死活的方法。

实验前的思考 体外培养细胞常常需要测定细胞的培养密度,即单位体积内的细胞数,同时还需要鉴别细胞的死活,从而了解细胞的存活情况。细胞密度测定最常用的工具是血球计数板,细胞死活测定的最简单方法是染料排斥法,常用鉴别染料为台酚蓝。

材料器具 蟾蜍或小白鼠的骨髓细胞;显微镜,血球计数板,吸管,培养皿,试管,软布或擦镜纸;0.4%台酚蓝染液,两栖动物生理盐水(0.65%氯化钠溶液)或哺乳动物生理盐水(0.9%氯化钠溶液)。

步骤

1.制备骨髓细胞悬液 具体方法参见第660页实验“赡蜍骨髓细胞染色体的制备”。

2.细胞计数准备 取一副血球计数板,用软布或擦镜纸擦净,把盖玻片盖在血球计数板中央的计数室上。把上述制得骨髓细胞悬液摇匀,用吸管吸取少量细胞悬液轻轻地滴在计数室边缘的斜面上,让它自然地流入盖玻片下的空隙,均匀地充满在计数室内。悬液不能过多或过少,过多会使盖玻片浮起,过少会出现空隙或气泡。如果有上述现象必须洗去,擦干重做,否则会影响计数准确性。

3.细胞计数方法 静置2~3分钟,待细胞在计数室下沉后,在低倍镜下计数(详见本书第777页实验《血细胞的计数》。

4.细胞存活力鉴别 取0.5毫升骨髓细胞悬液放入小试管里,再加0.4%台酚蓝染液0.5毫升,用吸管轻轻吹打混匀,染色2~3分钟。然后把悬液摇匀,吸取悬液滴一滴在干净载玻片上,加盖玻片,在低倍镜下,随机计数上、下、左、中、右五个视野内的细胞总数和被染成蓝色的细胞数,蓝色细胞为死细胞,按以下公式计算细胞存活率:

上述细胞计数和细胞存活力测定也可以合并在一起做。

分析和讨论

1.细胞计数时,应该先调焦,看清计数板上的格线。细胞密度太高时,计数不便,应该先把原液稀释若干倍后再计数,随后把测得结果乘以稀释倍数即为原液细胞密度。计数时,以每大格点数在几十到一百多为宜。

2.台酚蓝染液一般不能渗透到活细胞里,所以活细胞不会着色。但是如果延长染色时间或提高染液的浓度,造成活细胞膜损伤时,活细胞也可着色。所以,使用中应该掌握好有关条件。

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