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人体外周血淋巴细胞染色体的制备

2019-06-29 16:03:50 养殖种植技术书籍

人体外周血淋巴细胞染色体的制备

目的 学会无菌操作细胞培养技术和人体外周血淋巴细胞染色体制备技术,为染色体组型分析打下基础。

实验前的思考 人体微量全血培养技术是60年代后发展起来的。这技术的优点是取血量少,操作方便,易推广。人体外周血是混合血,其中淋巴细胞在离体培养条件下不会分裂,所以在培养基里需要加入一种特殊的糖蛋白植物血球凝集素(简称PHA),它能刺激体外淋巴细胞转化为淋巴母细胞,进一步进行有丝分裂。经一定处理,就能制得人的体细胞染色体标本。这种方法已成为人体细胞染色体研究,包括先天性遗传病、癌症、放射效应、病毒感染、环境毒理等研究的基本方法。

材料器具 人全血0.2~0.8毫升;接种箱(内装紫外灯管),恒温箱,高压手提式灭菌锅,离心机,移液管,链霉素空瓶(代培养瓶),三角烧瓶,针筒抽滤器,0.45微米孔径的滤膜,量筒,离心管,采血针,针筒,剪刀,镊子,消毒棉球,精密pH试纸,载玻片;RPMI1640,小牛血清,肝素,PHA,青霉素,链霉素,5%碳酸氢钠溶液,2微克/毫升秋水仙素,0.075摩尔/升氯化钾溶液,甲醇,乙酸,吉姆萨(Giemsa)染液。

步骤

1.器具灭菌。把洗净的移液管、链霉素空瓶、三角烧瓶、抽滤器、滤膜、量筒、采血针、针筒、剪刀和镊子等分别用纸包好后放入高压灭菌锅,在120℃下高压灭菌20分钟。

2.试剂瓶放入接种箱,开启紫外灯照射15分钟。洗净双手,关掉紫外灯,手伸入接种箱用75%乙醇棉球擦洗手指。按以下比例配制培养基:40毫升RPMI1640(事先配成1%水溶浓);小牛血清10毫升;肝素0.3毫升;PHA0.4毫升;青、链霉素各0.3毫升(100单位/毫升)。混匀后,用5%碳酸氢钠溶液或0.5%盐酸调pH至6.8左右。

把上述混合培养基用针筒式抽滤器经0.45微米孔径的滤膜抽滤,除菌后分装入链霉素空(培养)瓶,每瓶5毫升,加盖备用。

3.采血 用肥皂洗净供血者的手,用75%乙醇棉球拭擦指尖,用无菌采血针刺破指尖,迅速用无菌吸管吸血0.2~0.3毫升血液(见前一页图)滴入培养瓶,轻轻摇动混匀,加盖,用胶布封口。

4.培养 把上述贮血的培养瓶放在37℃恒温箱中,培养66~68小时。培养终止前6~10小时加2微克/毫升秋水仙素0.05毫升(5号针头约3滴),使最终浓度为0.02微克/毫升。

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