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植物原生质体的制备

2019-06-29 15:58:59 养殖种植技术书籍

植物原生质体的制备

目的 学习用酶溶解细胞壁的方法制备原生质体,为细胞生理研究提供必要基础。

实验前的思考 细胞内具有生命活性的粘稠物质叫做原生质。使用温和手段如用酶制剂可以消化植物细胞壁,从而获得大量完整、有活力的原生质体。通常用叶组织和培养细胞为材料制得的原生质体,可以用于细胞生理、生化、代谢、杂交等的研究。本实验具有重要的方法学意义,它是其他一系列细胞生理生化实验的基础。

材料器具 烟草叶片或胡罗卜肉质根,蚕豆叶片;无菌箱,电动离心机或手摇离心机,显微镜,恒温箱,针筒型微孔滤器,0.45微米微孔滤膜,离心管,吸管,培养皿,三角烧瓶,过滤漏斗,尼龙布,滤纸,吸水纸,手提式高压灭菌锅,剪刀,镊子,刀片;纤维素酶(EA3-867),甘露醇,氯化钙溶液,漂白精片,无菌水。

步骤

1.酶液的制备 把纤维素酶(EAS-867)溶于0.5~0.7摩尔/升甘露醇内,加10毫摩/升氯化钙溶液作稳定剂。酶溶解后,经4000转/分离心机沉降原生质体,20分钟后,取上清液。经针筒型过滤器,再经0.45微米微孔滤膜过滤后,在无菌箱内把酶液分装在三角烧瓶内,贮存在冰箱里备用。

2.材料准备 把生长在温室,苗龄60天以上的烟草植株,取上中部全展叶,在日光下照射2小时,使它萎蔫。也可以用温室生长的蚕豆叶作同样处理,或用大田收获的胡萝卜,放在0℃以上低温备用。萎蔫后的叶片浸在3%的漂白精片溶液中15~20分钟,再用无菌水冲洗干净,用无菌吸水纸吸干表面水分。

3.酶解 用尖头镊子撕去叶片下表皮,剪成小块。胡萝卜则用刀片削去表皮和中柱,取用皮层部,切成小块。以上材料1克,放入盛有10毫升酶溶液的培养皿里,加盖。在28~30℃下保温1.5~3小时。

4.洗涤 叶片或其他组织经酶解后会出现圆形的游离原生质体,原生质体悬浮液内有未消化的组织、碎片、细胞和破裂的原生质体。用滤纸或尼龙布滤去粗杂质,再把原生质体悬浮液移到离心管,用手摇离心机转动2分钟,吸去上清液(见图),再加入0.5毫升甘露醇洗涤2~3次,最后就得到较为纯净的原生质体,可以供进一步培养或作其他实验用。

注意事项

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