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细胞骨架的观察

2019-06-29 15:58:59 养殖种植技术书籍

细胞骨架的观察

目的 了解细胞骨架的化学性质、形态和分布,理解显示细胞骨架系统的原理,学会观察细胞骨架的方法。

实验前的思考 真核细胞中的细胞骨架由微管和微丝组成,可以通过电镜、免疫荧光技术来显示。还可以经特殊的组织化学方法处理,在光学显微镜下显示出来。

材料器具 新鲜的洋葱或大蒜头;显微镜(油镜),载玻片,盖玻片,镊子,刀片,吸水纸;指甲油或凡士林,0.2摩尔/升磷酸缓冲剂,25%戊二醛,TritonX-100抽提剂,甲醇,乙酸,考马斯亮蓝R250,蒸馏水。

步骤

1.3%戊二醛固定液的配制方法 以0.2摩尔/升磷酸缓冲剂(pH7.3)50毫升、25%戊二醛12毫升,加蒸馏水到100毫升。

2.1%TritonX-100抽提剂的配制方法 以1.0毫升TritonX-100加蒸馏水99毫升。

3.0.2%考马斯亮蓝R250染色液配制方法 以46.5毫升甲醇、7.0毫升乙酸、0.2克考马斯亮蓝R250溶入46.5毫升蒸馏水里。

4.取材 用小镊子撕取新鲜的洋葱或大蒜头的表皮,切成5毫米见方的小方块。

5.固定 把材料浸泡在3%的戊二醛固定液中15分钟。

6.抽提 把固定好的材料小心地用流水冲洗数次,吸水纸吸干后加入1%TritonX-100抽提,处理15分钟,溶解背景蛋白质。

7.染色 抽提后的材料再用水洗数次,吸干,用0.2%考马斯亮蓝R250染液染色30~60分钟。

8.封片 染色后的材料水洗约2分钟,洗去染料,盖上盖玻片,边缘可用指甲油或凡士林封住。

9.镜检 先用低倍镜,后转高倍镜观察,可以看到细胞的核区及细胞质中的细胞骨架成分被染成蓝色,呈放射状,从核向周围细胞质延伸。转用油镜,仔细调节微调焦旋钮,在细胞的不同水平面观察,可以看到细胞骨架结构的立体情况和纤维构成的网络结构。

注意事项 选用的材料要新鲜。染色过深,背景变蓝色,可以采用褪色办法补救,如延长水洗时间,或用二甲苯透明。

分析和讨论 显示在光学显微镜中的细胞骨架是经特殊的组织化学方法处理的。它的原理是用适当浓度的去垢剂TritonX-100处理,能溶解细胞膜和细胞内的许多可溶性蛋白质,而细胞骨架的蛋白质却不被破坏,用考马斯亮蓝R250能染色显示这些主要由微丝组成的骨架纤维束。

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