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细胞融合的化学诱导

2019-06-29 15:58:55 养殖种植技术书籍

细胞融合的化学诱导

目的 学习化学诱导细胞融合的操作技术,了解体细胞融合的概念。

实验前的思考 细胞融合是指两个或两个以上细胞合并形成一个细胞的过程。自发和人工诱导都能发生。细胞融合的诱导剂可以分成生物性和化学性两大类,后者最常用的是聚乙二醇。它是一种去垢剂,易得,用法简单,效果稳定。目前,细胞融合这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种的重要手段。

材料器具 小白鼠或蟾蜍;显微镜,水浴锅,手摇离心机,离心管,吸管,载玻片,盖玻片,试管,培养皿,注射器,针头,镊子,剪刀,酒精灯、卫生纸;RPMI640培养液,50%聚乙二醇。

步骤

1.RPMI640培养液的配制方法 称取RPMI640干粉1克,溶于100毫升蒸馏水中。

2.50%聚乙二醇(PEG)的配制方法 称取5克PEG(分子量4000),放入刻度离心管内,在酒精灯上文火加热,使它熔化。待冷却至50℃时,加入等体积经预热的RPMI640培养液混匀,放在37℃水浴保温备用。

3.截取股骨 选一只健康的小白鼠,用颈椎脱臼法处死后放在蜡盘中,腹面向上。用剪刀剪开小白鼠后肢大腿上的皮肤和肌肉,露出股骨及两端关节。然后从两端连关节头剪下股骨,用卫生纸擦净骨上残余肌肉。这一步操作时间要短,尤其是在环境温度较高时,以免骨髓细胞失活。

4.制备骨髓细胞悬液 在股骨两端小心剪去少量骨质,使骨髓腔暴露,注意不能剪去太多,以免骨髓细胞过多丢失。用镊子夹住股骨中部,用注射器抽取5毫升RPMI640培养液,针头从一端插入骨髓腔,冲洗出腔内的骨髓细胞置于培养皿内。冲洗后的培养液可以再吸回,重新冲洗,至骨髓腔变白为止。这时,培养液内骨髓细胞密度可以增至每毫升105个以上。

5.浓集细胞 细胞悬液移入离心管中,使手摇或电动离心机以800转/分运转8分钟,倾去上清液后把离心管倒放在滤纸上,流尽剩余培养液,以免残留液体改变后面诱导剂的浓度。

6.PEG诱导 用手指轻弹离心管底壁,使沉淀细胞松散。吸取制备好的50%的PEG约0.5毫升放在37℃的水浴中。在90秒内逐滴加入离心管中,边加边振荡离心管,使它跟细胞混匀。然后加入8~10毫升培养液,用吸管轻轻吹打混匀,在37℃水浴中静置5分钟以稀释PEG。开动离心机,弃去上清液后,加入1~2毫升培养液,在37℃水浴中再温育30分钟。

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