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原生质体融合的验证

2019-06-29 15:58:53 养殖种植技术书籍

原生质体融合的验证

目的 学习原生质体的化学诱导融合方法,理解融合的原理和意义。

实验前的思考 植物细胞杂交,要预先制备原生质体,然后进行原生质体诱导融合。这种诱导可以在种内,也可以在种间,甚至属间、科间进行。诱导融合有物理法和化学法。物理法如电场法、离心法、振动法等。化学法是用不同试剂作诱导剂,其中最有效和常用的是聚乙二醇(PEG)。融合细胞继续培养,就成为杂交细胞。细胞杂交具有重要的理论和应用价值。

材料器具 烟草(或胡萝卜、大麦)原生质体;显微镜,恒温水浴锅,手摇离心机,注射器过滤器,0.45微米滤膜,尼龙过滤布,镊子,刀片,培养皿,吸管,离心管,微量滴管,载玻片,吸水纸;原生质洗涤液,高pH-高钙液,PEG诱导液。

步骤

1.原生质体制备 参见本书第28页[植物原生质体的制备]。

2.融合处理 取混和均匀的两亲本(可同种也可异种)原生质体150微升(即0.15毫升或滴管1~2滴),滴在载玻片上,上加培养皿盖防污染和蒸发。静置15分钟,使原生质体下沉。用微量吸管吸取约3倍原生质体悬液(约450微升)的PEG溶液,小心而缓慢地从四周滴入,25~30℃温育(即在此温度下培育)20~30分钟,促使原生质体相互粘连。镜检可以看到两亲本原生质体集聚。

保温后,再吸高pH-高钙液0.5毫升缓慢地从四周滴入混合液中,10分钟后,再重复1次,进一步促进融合。

3.融合剂的洗涤 从混合液的一边小心吸去大半溶液,注意不能吸干。另一边再加入1毫升新鲜洗涤液。5分钟后进行第2次洗涤,如此重复3~5次。在显微镜下可以看到融合的原生质体呈球形或椭圆形(见图)。计算融合百分比。

注意事项

1.原生质体的脱壁是否完全会影响融合效果。有的原生质体会很快再生细胞壁,因此在洗去酶液后,应立即进行融合处理。

2.原生质体的悬浮状况也会影响融合,如果两亲本原生质体密度相差较大,就难以混和均匀,接触机会减少,这时应用离心方法强迫它们密集。

3.洗涤时很容易丢失原生质体,应该小心从事,并注意镜检。

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