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柑橘黄龙病菌分子检测技术的建立应用及梨火疫

2020-04-08 16:00:42 柑橘树

【摘要】:相柑橘黄龙病(CitrusHuanglongbing),属于系统侵染的细菌病害,病原是韧皮部杆菌亚洲种(CandidatusLiberibacterasiaticus),属于难培育细菌。该病病症繁杂,易与缺素、病毒病害等混淆。柑橘黄龙病在内地产生很严重,严重为害柑橘产业链。目前对于黄龙病尚无合理治理手段,主要依靠严格的检疫对策避免该病扩散,所以建立高效,便捷,实际操作简要的检测技术,为疑似柑桔黄龙病初期的诊断提供准确、靠谱的检验检疫技术,是避免此病原菌传布合理手段。现在检验柑橘黄龙病菌的主要法子是PCR,虽然简要便捷、准确灵巧,了却由于柑橘黄龙病原是难培育细菌,在植株组织中分布不均且含量少,病原DNA的得到全历程烦琐,再加上当前的大都黄龙病病原菌分子检测使用的靶标均未经由基因组较为,因而基础PCR有时会出现假阴性或假阳性问题。本实验通过本地BLAST软件,采用单序列比多序列的法子,将目的菌Ca.L.asiaticus的全基因组序列依次与同属的每个其他种的全基因组序列发起比对。选用多序列比对的全基因组比对技术,在全基因组比对的基本上挑选出了合适的关键基因当作分子靶标,设计出了特异性的探针和引物,建立了 Routine PCR和TaqMan探针q-PCR的检测法子,实验结果阐明这两种法子均能把目标菌韧皮部杆菌亚洲种Caa.L.asi与 Cau.L.L.amenus、Caaican 及 Ca L.solanacear 3 个种区分离来,最高灵巧度超过6copies/μL,等于能检测出0.01 fg/μL的DNA,具有良好的特异性和高灵巧度。对实际样品发起检测,能从24份湖南疑似黄龙病叶片样品中检测到3份带菌,有较高的检出率。除此之外,梨火疫病菌(Erwinniaamylovora)可引起梨、苹果等蔷薇科植物的火疫病。本研究从梨火疫病菌中评定并克隆出两个clpV同源基因,通过同源重组的法子,搭建了梨火疫病菌的clpF基因的缺失突变体△clpV-1和△clpV-2,初步剖析了△clp V-1和AclpV-2在影响病原菌致病性和梨火疫毒素产量的作用。结果显示,△clpV-2与野生型相比致病性显著减少,梨火疫毒素产量显著递减,而△clpV-1与野生型相比差别不显著。

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