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不同样连作年数草莓根际细菌和真菌多样性转变

2019-11-08 22:35:27 草莓

草莓(Fragaria ananassa Duch)属蔷薇科(Rosaceae)草莓属植物,是一种营养使用价值和经济使用价值较高的水果,因其色、香、味俱佳,深受客人青睐。草莓的主要栽培方式为一年一栽,主产区草莓连作障碍现象不仅在我国广泛存有,全世界栽培草莓地域连作障碍同样普遍存有。草莓在同一地块上连续种植2年以上,地底病害虫逐年严重,草莓长势逐年变弱,表现为植株发育受阻,甚至植株死亡,果品质量逐年变劣,产量逐年递减。草莓连作障碍已成为草莓栽培者及研究者普遍关注的聚焦。目前,我国已经成为世界第一大草莓出产国[],草莓连作障碍已严重制约了草莓产业链的发展,亟待处置。泥土微生物影响着泥土养分的吸收和转化,微生物种群结构失衡是造成泥土质量递减、作物限产的主要理由[]。傅佳等[]、周陈等[]研究阐明,泥土微生物数量转变直接或间接影响泥土中养分的转化。作物连作年数过长,养分消耗单一化,肥力程度递减,不利于养分的均衡供求均衡,泥土微生物活性减少,影响了养分的利用效率,泥土微生物种群结构合不来理,有害微生物数量逐渐占优势[]。传统式的泥土微生物研究法子如微生物平板培育法、Biolog评定系统法、生物标识法等[]往往会过低估算泥土微生物的群落结构构成,无法详细叙述出泥土微生物的群落结构构成方面的信息,也无法勾勒出不同样群体的生理差别。第二代测序Illumina MiSeq法子合理地防止了通量低、实际操作繁杂和准确率低等缺陷[-],具有实际操作简要、成本较低的优势,而且采用边合成边测序原理,结果可靠度高。MiSeq高通量测序平台,不仅可实现对多样品的多个可变区同时测序,并且在测序速度和测序通量上都有进一步加强。目前此平台已在微生物多样性群落结构研究方面换取普遍应用[-]。一些研究发现随草莓连作时间逐年增加,根际泥土中细菌数量逐渐减少,真菌数量逐渐升高,细菌和真菌的比值逐渐减少,泥土微生物由“细菌型”向“真菌型”变迁,说明泥土真菌与草莓连作关系密切,其中病原真菌是草莓连作障碍因子之一,主要包含镰刀菌属、丝核菌属、轮枝菌属、疫霉属、腐霉属、拟盘多毛孢属和炭疽菌属等致病真菌。中国以镰刀菌和丝核菌为主[]。不同样连作年数草莓根际泥土细菌、真菌群落多样性转变目前还不清楚,本研究以不同样连作年数草莓根际泥土为材料,采用高通量测序技术,探讨不同样连作年数泥土细菌、真菌多样性的转变,以期为草莓连作障碍调控提供基础理论结论。

1 材料与法子

试验于2016年9−11月在江苏省农业科学研究院草莓温室大棚发起。

1.1 试验材料

试材为生长整齐一致的三叶一心期“宁玉”草莓苗;盆栽泥土分別收集于江苏省农业科学研究院白马植物基地里3个相邻的农田耕作层,其中一个农田已经荒废多年沒有开垦(CK),一个农田连作1年(1Y)草莓且之前一直荒废多年,另外农田连作8年(8Y)草莓。泥土常规理化性质见。

表 1 供试泥土常规理化性质 Table 1 The basic physical and chemical properties of the tested soil

处理
Treatments
  pH   有机质
OM (g/kg)
  全氮
Total N (g/kg)
  全钾
Total K (mg/g)
  全磷
Total P (g/kg)
  碱解氮
Alkalyzable N (mg/kg)
  速效磷
Available P (mg/kg)
  速效钾
Readily available K (mg/kg)
 
CK   7.31   21.49   0.85   10.68   1.02   65.28   42.38   229.30  
1Y   6.80   38.40   2.35   12.61   2.01   142.53   97.49   389.53  
8Y   6.79   32.22   2.38   12.34   2.12   153.67   110.02   491.99  

1.2 试验设计

将每种不同样连作年数的泥土与珍珠岩以3:1的体积充分混匀装盆。塑料盆直径15 cm,深18 cm,每盆装土1 500 g,每盆栽草莓一株。草莓苗于2016年9月10日定植,定植后早晚各浇一次水而且适当遮阴7 d,后来正常水肥光照管理诀窍,温度维持在20−25 ℃之间,光周期约12 h (昼)/12 h (夜)。定植后50 d时(盛开前)发起泥土取样及测定剖析。各个泥土处理选取长势相似的3盆草莓,采用抖土法获取粘附在根系表层上的根际泥土并充分混匀,重复3次。取得的根际泥土一份于−20 ℃冷冻储存用于泥土微生物剖析,一份4 ℃储存备测。

1.3 试验法子 1.3.1 泥土微生物基因组DNA的提取: 提取试剂盒为Omega泥土微生物DNA提取试剂盒,称取0.5 g −20 ℃储存的泥土样品,按试剂盒的试验流程发起泥土微生物总DNA的提取,DNA样品于−20 ℃储存待用。

1.3.2 试验步骤: 提取样品总DNA后,根据设计换取细菌V4+V5 (F:5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′,R:5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)和真菌ITS1+ITS2 (F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGT AA-3′,R:5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)合成的引物,合拼引物连接头,发起PCR扩增。PCR反应体系:含15 mmol/L MgCl2的10×Buffer 10.0 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL,10 μmol/L引物各5.0 μL,5 U/μL Taq酶1.0 μL,DNA模板4.0 μL,灭菌去离子水73.0 μL,总体积100 μL。PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30个循环;72 ℃ 10 min。然后对其产物发起纯化、定量和均一化形成测序文库,建好的文库先发起文库质检,质检合格的文库用Illumina HiSeq PE250发起测序,由南京集思慧远生物科技有限公司完成测序。

1.4 生物信息剖析法子 1.4.1 数据过滤及质量评估: 数据过滤主要流程如下:(1) 除去平均质量值低于20的长Reads;(2) 除去Reads含N的碱基数达到3个的长Reads;(3) Reads长度范围为220−500 nt。

1.4.2 序列优化: 利用Mothur软件(version 1.34.4,)发起序列优化,主要流程[]如下:(1) 对序列发起筛选,除去模模糊糊碱基数大于0、单碱基高重复区大于8、重叠区错配数大于0及长度大于97.5%的序列(细菌)、重叠区长小于20 bp的序列(真菌);(2) 发起去冗余处理。

1.4.3 OTU聚类剖析: 为便于下游物种多样性剖析,将Tags聚类为OTU (Operational taxonomic units)。首先把拼接的Tags中的Singletons (对应Reads不过一条的序列)过滤掉,因为Singletons将会由于测序不对导致,凡是将这一部分序列除去,不添加聚类剖析,利用Usearch在0.97相似度下发起聚类,对聚类后的序列发起嵌合体过滤后,换取用于物种分类的OTU,每个OTU被认为可代表一个物种。

1.5 数据剖析

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